La inyección de diferentes concentraciones de colágeno recombinante humanizado tipo III en la dermis promueve la deposición de colágeno tipo III y tipo I, así como la angiogénesis
El colágeno es la proteína estructural más abundante en los tejidos conectivos humanos, constituyendo aproximadamente el 30% del contenido total de proteínas en el cuerpo. Es un componente clave de los tejidos conectivos como la piel, los huesos, los tendones y los ligamentos, proporcionando fuerza y elasticidad. Existen varios tipos de colágeno, siendo el tipo I y el tipo III los predominantes en la piel, representando aproximadamente el 70% y el 15% del colágeno cutáneo total, respectivamente.
Se acepta ampliamente que, durante el proceso de envejecimiento, el aumento en la degradación y la disminución en la síntesis de colágeno en la matriz extracelular conducen a la formación de arrugas y a la pérdida de elasticidad de la piel. Hasta ahora, se han desarrollado diversos rellenos dérmicos —como colágeno, ácido hialurónico e hidroxiapatita de calcio— para compensar la pérdida de volumen de la matriz extracelular. Entre estos rellenos, el colágeno presenta un gran potencial debido a su baja tasa de reacciones adversas, alta biocompatibilidad y efecto de relleno natural.
Gracias a los avances en la ingeniería genética, segmentos específicos de genes humanos que codifican la producción de colágeno pueden integrarse en nuevos sistemas de producción, como la levadura y las bacterias. Esto permite la síntesis estable y eficiente de colágeno con alta biocompatibilidad con el cuerpo humano. A este tipo de colágeno se le denomina colágeno recombinante.
La Administración Nacional de Productos Médicos de China ha emitido una guía sobre los estándares de definición del colágeno recombinante, clasificando los productos de colágeno recombinante en tres tipos distintos:
1. Colágeno humano recombinante: codificado por genes humanos específicos de colágeno y que posee la secuencia completa de aminoácidos con una estructura de triple hélice.
2. Colágeno humanizado recombinante (rhCol III): definido como secuencias completas o fragmentarias de aminoácidos funcionales codificados por genes específicos de colágeno humano, o combinaciones de dichos fragmentos funcionales.
3. Proteína similar al colágeno recombinante: consiste en secuencias o fragmentos de aminoácidos codificados por genes de colágeno diseñados y modificados, o combinaciones de tales fragmentos.
De hecho, la producción de colágeno humano recombinante sigue siendo altamente desafiante hasta la fecha. La mayoría de las empresas o instituciones involucradas en la producción de colágeno solo pueden producir rhCol III. Dado que el rhCol III cuenta con una tecnología de producción en masa más avanzada y una estructura altamente similar al colágeno humano recombinante, los autores consideran que el rhCol III tiene el mayor potencial para lograr una traducción clínica en el corto plazo.
El colágeno tipo III (COL III) es una microfibrilla que normalmente coexiste con el colágeno tipo I (COL I), proporcionando elasticidad a la piel. Los estudios han demostrado que el COL III se degrada más rápidamente durante el envejecimiento cutáneo y que una mayor proporción COL III/COL I se asocia con una piel más joven, menos cicatrices visibles y cicatrices postoperatorias de mayor calidad. Además, se ha verificado que el COL III posee la capacidad de promover la reparación y regeneración cutánea.
Dadas estas características del COL III, el colágeno humanizado recombinante tipo III inyectable posee un enorme potencial para aplicaciones cosméticas clínicas y oportunidades de traducción. Hasta la fecha, solo existen unos pocos estudios in vivo que demuestran que el colágeno recombinante está asociado con la cicatrización de heridas y la atenuación del fotoenvejecimiento. Sin embargo, faltan estudios observacionales continuos sobre el efecto global de la inyección intradérmica de diferentes concentraciones de colágeno recombinante tipo III en la piel.
Este estudio tiene como objetivo inyectar de manera eficiente diferentes concentraciones de colágeno humanizado recombinante Tipo III en la dermis de ratones mediante la administración con microagujas, y observar de forma continua sus efectos sobre la deposición de colágeno cutáneo, la proliferación celular y la angiogénesis en distintos puntos temporales.
Materiales y Métodos – Experimento en Animales
Se adquirió un total de 20 ratones BALB/c de ocho semanas de edad (25 ± 2 g) en el centro de animales experimentales del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín. El experimento con animales fue aprobado por el Comité de Ética de dicho hospital.
El día previo a la inyección, se rasuraron las áreas dorsales de los ratones y se trataron con crema depilatoria. Cada área rasurada se dividió en 4 cuadrantes. De manera secuencial, desde el cuadrante superior izquierdo hasta el inferior derecho, los autores inyectaron 100 μL de solución salina, rhCol III a baja concentración (6 mg/mL) (YF20231118, Onlyfun, Jland Biotech, China), rhCol III a alta concentración (30 mg/mL) (YF20220905, Onlyfun, Jland Biotech, China) y nuevamente solución salina, utilizando administración mediante microagujas (Figura 1).
Los dos productos de rhCol III utilizados aún se encuentran en fase de investigación. Para evitar la interacción por difusión, se inyectaron el rhCol III de baja concentración y el de alta concentración en cuadrantes diagonales, respectivamente.
El experimento se dividió en 3 grupos:
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Grupo control: inyección de solución salina.
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Grupo de dosis baja (LD): rhCol III a baja concentración.
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Grupo de dosis alta (HD): rhCol III a alta concentración.
A las semanas 1, 2, 3 y 4 después de la inyección, un número igual de ratones fue sacrificado aleatoriamente. Posteriormente, se recolectaron muestras de piel de espesor completo para su evaluación histológica.
Para facilitar la descripción, los autores se refieren a la primera, segunda, tercera y cuarta semanas posteriores a la inyección como el primer, segundo, tercer y cuarto punto de observación, respectivamente, en el presente texto.
Tinción con Hematoxilina-Eosina y Tricrómica de Masson
La piel de espesor total obtenida se fijó en paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Luego se incluyó en parafina y se cortó en secciones de 5 μm. Se aplicó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para examinar el impacto de las inyecciones intradérmicas en el estado general de la piel, como el grosor de la epidermis y la dermis, y la infiltración de fibroblastos.
La tinción tricrómica de Masson se utilizó para observar las alteraciones en la deposición general de colágeno en el sitio de inyección.
Análisis inmunohistoquímico
Para investigar más a fondo las diferencias entre las inyecciones intradérmicas con distintas concentraciones de rhCol III, los autores realizaron tinciones inmunohistoquímicas para colágeno tipo I, colágeno tipo III, PCNA y CD31 en los tejidos cutáneos recolectados.
En resumen, las secciones fueron primero desparafinadas e hidratadas, seguidas de dos rondas de calentamiento en microondas para la recuperación antigénica. Luego, se trataron con H₂O₂ al 3% y se incubaron con albúmina sérica de cabra al 5%. Posteriormente, se incubaron durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos, respectivamente:
• Colágeno I (1:500, ab138492; Abcam, Estados Unidos)
• Colágeno III (1:500, ab6310; Abcam)
• PCNA (1:1000, ab29; Abcam)
• CD31 (1:200, GB113151; Servicebio, China)
Después, se incubaron con un anticuerpo secundario HRP (1:200; Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de la visualización con diaminobencidina. Tras ser contra teñidas con hematoxilina, las secciones fueron deshidratadas y montadas.
Adquisición de imágenes mediante microscopía láser de barrido de dos fotones
Se utilizó un microscopio láser de barrido de dos fotones (TCS-SP8 DIVE; Leica, Alemania) para evaluar la calidad del colágeno. En resumen, el haz de excitación se enfocó en la piel obtenida utilizando un lente objetivo de 20× (NA = 1). Se empleó un láser pulsado a 850 nm para adquirir la señal de generación de segundo armónico (SHG) del colágeno, la cual se detectó mediante filtros de paso de banda entre 400 y 450 nm. Todas las imágenes fueron adquiridas y procesadas con el software LAS X (Leica, Alemania).
Análisis cuantitativo y estadístico
Para analizar cuantitativamente los cambios en la deposición total de colágeno, colágeno tipo I, colágeno tipo III, PCNA y CD31, los autores seleccionaron aleatoriamente 5 regiones en las secciones de cada grupo con la misma magnificación, y realizaron la cuantificación utilizando el software ImageJ.
La significancia estadística entre los diferentes grupos se determinó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, usando GraphPad Prism 8.0.2 (La Jolla, CA).
Se consideraron diferencias estadísticamente significativas aquellas con p < 0.05.
Para ilustrar más claramente las diferencias entre los grupos de alta dosis (HD), baja dosis (LD) y control, todos los datos se presentaron como múltiplos relativos al grupo control.
Tinción con hematoxilina y eosina
Las imágenes representativas de la tinción H&E se muestran en el Contenido digital suplementario 1, Figura S1A (http://links.lww.com/DSS/B587).
Los autores investigaron primero si la inyección de rhCol III provocaba una respuesta inflamatoria en la dermis. Durante 4 semanas no se observó una infiltración inflamatoria significativa ni formación de granulomas, lo que indica buena biocompatibilidad.
Además, el espesor dérmico no mostró diferencias significativas entre los grupos experimentales y el control.
En el primer punto de observación, tanto el grupo HD como el LD exhibieron un leve engrosamiento epidérmico. Sin embargo, solo el grupo HD mostró una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo control (p < 0.05), y este engrosamiento se observó solo en ese primer punto (ver Figura S1B).
El número de folículos pilosos aumentó significativamente en el grupo LD en el segundo (p < 0.05) y cuarto (p < 0.01) puntos de observación en comparación con el grupo control. En cambio, no se observó un aumento significativo en el grupo HD.
El grupo HD mostró un aumento significativo en el número de fibroblastos en los 4 puntos de observación (p < 0.0001) respecto al control. En el primero (p < 0.0001), tercero y cuarto (p < 0.05) puntos, el grupo HD también presentó más fibroblastos que el LD.
Aunque el grupo LD también mostró un incremento, este fue menos pronunciado. El grupo LD alcanzó un máximo de 1,98 veces más fibroblastos que el control, mientras que el grupo HD alcanzó un máximo de 2,5 veces.
Deposición de colágeno
En este estudio sobre los cambios en la deposición de colágeno, los autores evaluaron inicialmente las alteraciones generales mediante tinción tricrómica de Masson y la microscopía de dos fotones para examinar la calidad del colágeno. Finalmente, se analizaron las diferencias en colágeno tipo III y tipo I mediante tinción inmunohistoquímica para Col III y Col I.
En el primer punto de observación tras la inyección, tanto los grupos LD como HD mostraron un aumento significativo en la deposición de colágeno (p < 0.001), sin diferencias significativas entre ellos (ver Figura S2A y B). Sin embargo, desde el segundo punto de observación en adelante, el grupo HD presentó una deposición de colágeno más pronunciada que el LD (p < 0.0001); aunque esta diferencia disminuyó en los puntos posteriores, se mantuvo hasta el cuarto.
El grupo LD mostró un aumento máximo de 1,87 veces, mientras que el HD alcanzó un máximo de 2,97 veces respecto al control. En los 4 puntos de observación, ambos grupos mostraron incrementos de colágeno en distintos grados frente al control.
Las observaciones iniciales respaldan que la inyección intradérmica de rhCol III genera una deposición significativa de colágeno, independientemente de la concentración, con un efecto que se prolonga más de 4 semanas, siendo mayor en concentraciones altas.
La Figura 2 muestra imágenes representativas de microscopía de dos fotones, donde la señal blanca representa las fibras de colágeno: señales más brillantes y texturas más definidas indican una mayor deposición y una organización más ordenada del colágeno.
Estos resultados sugieren que las inyecciones de rhCol III aumentan la deposición total de colágeno de manera dependiente de la concentración, y que las fibras presentan una disposición más uniforme (flechas rojas), lo que implica una mejor calidad estructural del colágeno en el sitio de inyección.
Los autores evaluaron luego los cambios en el colágeno tipo III (Col III). Se observaron incrementos significativos en todos los puntos de observación del grupo HD, alcanzando un máximo de 1,87 veces respecto al control (Figura S3A, B).
En el grupo LD, el Col III aumentó significativamente en todos los puntos excepto el segundo, con un máximo de 1,59 veces frente al control. En el segundo y cuarto puntos, la deposición de Col III en el grupo HD fue significativamente mayor que en el LD (p < 0.01), lo que sugiere que las diferentes concentraciones de rhCol III pueden no mostrar diferencias notables al inicio, de forma similar al análisis del colágeno total.
Además del Col III, el Col I también mostró diferentes grados de sobreexpresión en ambos grupos (ver Contenido digital suplementario 1, Figuras S4A y S4B, http://links.lww.com/DSS/B587).
En el grupo HD, la sobreexpresión fue estadísticamente significativa en 3 de los 4 puntos de observación, alcanzando un aumento máximo de 1,79 veces en comparación con el grupo control.
En el grupo LD, solo el incremento en el segundo punto de observación fue estadísticamente significativo frente al control (p < 0.05).
Aunque la sobreexpresión de Col I en el grupo HD respecto al grupo LD fue estadísticamente significativa únicamente en el cuarto punto de observación (p < 0.05), el grupo HD mostró una mayor deposición de Col I que el grupo LD en todos los puntos observados.
Al combinar las comparaciones de los grupos HD y LD con el grupo control, estos resultados demuestran que el grupo HD posee una mayor capacidad para inducir la producción de Col I.
Proliferación celular y angiogénesis
Los fibroblastos son las principales células de la dermis encargadas de secretar colágeno tipo I (Col I) y colágeno tipo III (Col III).
Estudios previos han demostrado que los andamios elaborados con rhCol III in vitro ejercen cierto efecto promotor de la proliferación de fibroblastos, sin embargo, existe una carencia de investigaciones sobre su inyección intradérmica directa.
La capacidad para promover la angiogénesis también es un criterio importante al evaluar los rellenos dérmicos, ya que la densidad vascular de la piel disminuye con la edad, lo que resalta la función crucial de la angiogénesis en el mantenimiento de la juventud facial.
Por lo tanto, los autores examinaron la tinción de PCNA y CD31 en tejidos cutáneos para evaluar los cambios en la proliferación de fibroblastos y en la angiogénesis.
La tinción con PCNA reveló una proliferación celular significativamente mayor en los grupos de alta dosis (HD) y baja dosis (LD) en el segundo y cuarto puntos de observación, en comparación con el grupo control (ver Contenido digital suplementario 1, Figuras S5A y S5B, http://links.lww.com/DSS/B587).
El grupo HD mostró un aumento más pronunciado en la proliferación de fibroblastos (p < 0.05).
No se observaron cambios significativos en el primer y tercer puntos, posiblemente debido a una respuesta retardada frente a los cambios en la matriz extracelular.
Es importante destacar que las tendencias observadas en la tinción de PCNA corresponden estrechamente con las observadas en la tinción de Col I, lo que sugiere una fuerte correlación entre el aumento en la proliferación de fibroblastos y la mayor producción de Col I.
En el grupo HD se observó mayor angiogénesis en el tercer y cuarto puntos de observación, con 1,61 veces (p < 0.01) y 1,40 veces (p < 0.001) los niveles del grupo control, respectivamente (ver Contenido digital suplementario 1, Figuras S6A y S6B, http://links.lww.com/DSS/B587).
El grupo LD también mostró aumento de la angiogénesis en el primer, tercer y cuarto puntos de observación, con incrementos de 1,56 veces (p < 0.01), 1,37 veces (p < 0.05) y 1,27 veces (p < 0.01), respectivamente.
En todos los puntos de observación, los autores no encontraron evidencia de que una mayor concentración de rhCol III produjera más angiogénesis, lo que sugiere que la inyección de rhCol III favorece la angiogénesis, pero este efecto no depende de la concentración.
Discusión
El colágeno humano recombinante tipo III (rhCol III) ha recibido gran atención recientemente debido a su excelente biocompatibilidad y facilidad de fabricación.
A nivel mundial, aunque algunos estudios clínicos han demostrado su eficacia en el tratamiento de la epicondilitis lateral (codo de tenista) y en la regeneración corneal, la mayoría de las investigaciones siguen limitadas a estudios in vitro y en modelos animales.
Los autores consideran que el rhCol III es un relleno dérmico inyectable prometedor que podría utilizarse ampliamente en cirugía estética, aunque actualmente faltan datos de observación continua sobre los cambios cutáneos tras inyecciones intradérmicas con diferentes concentraciones.
En este estudio, se utilizó un dispositivo de microinyección para administrar diferentes concentraciones de rhCol III en la dermis de ratones y se realizó un seguimiento continuo de los cambios inducidos.
Los resultados mostraron que las inyecciones intradérmicas de rhCol III inducen un aumento en la formación de colágeno de manera dependiente de la concentración, lo cual coincide con las expectativas de los autores.
Sin embargo, no se observaron cambios significativos en el grosor dérmico, lo que contradice la experiencia clínica de que los inyectables suelen aumentar dicho grosor.
Esto podría deberse a que el colágeno depositado se reorganiza en una estructura más densa, mientras que otros componentes de la matriz extracelular, como elastina y ácido hialurónico, no presentan cambios relevantes, resultando en ausencia de aumento visible del volumen dérmico.
Estudios relacionados también sugieren que una mayor deposición de colágeno no necesariamente incrementa el espesor dérmico.
Un hallazgo significativo de esta investigación fue que, aunque se inyectó rhCol III, el Col I se sobreexpresó en ambos grupos (HD y LD) en diferentes grados, a menudo con niveles similares a los del Col III.
Los autores atribuyen este aumento del Col I a la mayor proliferación y migración de fibroblastos.
Se ha reportado que los fibroblastos expresan de forma abundante las integrinas α1β1, α2β1 y α11β1, las cuales pueden interactuar con sitios de reconocimiento como GVOGEA, GASGER y GFOGER presentes en el rhCol III, regulando la adhesión, proliferación y remodelación de la matriz extracelular.
Los autores observaron un aumento en el número de fibroblastos y en la deposición de colágeno en el punto de observación inicial, aunque sin un cambio significativo en la proliferación de fibroblastos, lo que demuestra que el rhCol III promueve la migración y adhesión fibroblástica, en concordancia con los hallazgos de Chen y colaboradores.
Asimismo, se ha demostrado que un inhibidor de la interacción integrina-ligando (péptido RGD) puede bloquear esta adhesión celular, reforzando el papel crítico de las integrinas.
En las observaciones de la tinción con PCNA, los autores encontraron que su tendencia se correlaciona con las de Col I y Col III, mostrando una mayor sobreexpresión en el segundo y cuarto puntos de observación. Esto indica que, tras la fase inicial, la proliferación de fibroblastos juega un papel dominante en la deposición de Col I y Col III.
Los hallazgos también sugieren que el principal efecto de aumentar la concentración de rhCol III en las inyecciones intradérmicas recae sobre los niveles de proliferación de fibroblastos, ya que en el primer punto de observación los niveles de colágeno del grupo HD no superaron significativamente a los del grupo LD.
En los puntos posteriores, el grupo HD mostró una mayor capacidad de promover la proliferación fibroblástica, lo que se tradujo en niveles más altos de colágeno en comparación con el grupo LD.
La densidad vascular es un aspecto crucial para mantener la juventud facial y un criterio de evaluación clave de los rellenos dérmicos.
Estudios han demostrado que la densidad vascular disminuye con la edad, y que la inyección de VEGF-A puede promover la rejuvenecimiento cutáneo.
Investigaciones previas sobre rellenos dérmicos no biocompatibles, como el hidroxiapatita de calcio y el ácido poli-D,L-láctico, han mostrado que favorecen la angiogénesis, aunque no se evaluó si el efecto dependía de la concentración.
Los resultados del presente estudio indican que las inyecciones intradérmicas de rhCol III producen una mayor angiogénesis local en etapas posteriores, independientemente de la concentración utilizada.
Limitaciones del estudio
1. Los resultados se basan principalmente en evaluaciones histológicas, lo cual representa un método de análisis limitado.
2. Durante el período de observación (4 semanas), la deposición de colágeno aún se encontraba en fase de incremento, por lo que futuros estudios deberán extender el seguimiento para evaluar los efectos a largo plazo del rhCol III.
3. No se realizaron evaluaciones histológicas de piel no tratada. Estudios previos han demostrado que procedimientos con agujas, como acupuntura o microinyecciones, pueden estimular la proliferación de fibroblastos y la deposición de colágeno, lo que sugiere que el propio procedimiento podría enmascarar parcialmente los efectos del rhCol III.
4. Finalmente, los autores reconocen la falta de un análisis mecanístico profundo que explique cómo el rhCol III promueve la proliferación de fibroblastos.